金黃色葡萄球菌檢測要點

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于微球菌科葡萄球菌屬，典型的金黃色葡萄球菌為球形，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽孢和鞭毛，大多數無莢膜，革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶陽性細菌，能夠產生很強的凝固酶陽性反應。該菌對營養要求不高，在普通培養基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37℃，最適pH 為7.4，生長pH范圍為4.2-9.8。該菌可耐受極低的水分活度（0.86），并可在含鹽或含糖濃度較高的食品中繁殖，在干燥環境下可存活數月，對熱有較強抵抗力。

金黃色葡萄球菌主要污染營養豐高且含較多水分的食品，如乳類及乳制品、肉類、剩飯等，其次為熟肉類，偶見魚類及其制品、蛋制品等。部分金黃色葡萄球菌能夠引發包括由于腸道毒素的消化吸收引發的胃腸炎等各種疾病綜合癥。

一系列產品稀釋液被接種到選擇性鑒別瓊脂培養基中，產生典型的金黃色葡萄球菌菌落，金黃色葡萄球菌菌落通過凝固酶反應確定。每克樣品的金黃色葡萄球菌數量以凝固酶陽性菌落的比例為基礎而計算得到。

初步鑒定

金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2mm-3mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質地較干燥。在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色),菌落周圍可見*透明溶血圈。挑取上述可疑菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。

確證鑒定

1.染色鏡檢:金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌,排列呈葡萄球狀,無芽胞,無莢膜,直徑約0.5μm-1μm。

2 血漿凝固酶試驗:挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個可疑菌落(小于5個全選),分別接種到5mLBHI和營養瓊脂小斜面,36℃±1℃培養18h-24h。

取新鮮配制兔血漿0.5mL,放入小試管中,再加入 BHI培養物0.2mL-0.3mL,振蕩搖勻,置36℃±1℃溫箱或水浴箱內,每半小時觀察一次,觀察6h,如呈現凝固(即將試管傾斜或倒置時,呈現凝塊)或凝固體積大于原體積的一半,被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養物作為對照。也可用商品化的試劑,按說明書操作,進行血漿凝固酶試驗。

結果如可疑,挑取營養瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI,36 ℃±1 ℃培養18h~48h,重復試驗。

結果與報告

1.結果判定:符合初步鑒定、確證鑒定的可判定為金黃色葡萄球菌。

2.結果報告:在25g(mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。

典型菌落計數和確認

1.金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2 mm-3mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣黏稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質地較干燥。

2.選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀釋度3個平板所有菌落數合計在20CFU-200CFU 之間的平板,計數典型菌落數。

3.從典型菌落中至少選5個可疑菌落(小于5個全選)進行鑒定試驗。分別做染色鏡檢,血漿凝固酶試驗;同時劃線接種到血平板36℃±1℃培養18h-24h后觀察菌落形態,金黃色葡萄球菌菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色),菌落周圍可見*透明溶血圈。

結果計算

1.若只有一個稀釋度平板的典型菌落數在20CFU-200CFU 之間,計數該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。

2.若稀釋度平板的典型菌落數小于20CFU,計數該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。

3.若某一稀釋度平板的典型菌落數大于200CFU,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,計數該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。

4.若某一稀釋度平板的典型菌落數大于200CFU,而下一稀釋度平板上雖有典型菌落但不在20CFU-200CFU范圍內,應計數該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計算。

5.若2個連續稀釋度的平板典型菌落數均在20CFU-200CFU 之間,按式(2)計算。

6.計算公式 式(1):

式中:

T ———樣品中金黃色葡萄球菌菌落數;

A ———某一稀釋度典型菌落的總數;

B ———某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數;

C ———某一稀釋度用于鑒定試驗的菌落數;

d ———稀釋因子。

式(2):

式中:

T ———樣品中金黃色葡萄球菌菌落數;

A1 ———稀釋度(低稀釋倍數)典型菌落的總數;

B1 ———稀釋度(低稀釋倍數)鑒定為陽性的菌落數;

C1 ———稀釋度(低稀釋倍數)用于鑒定試驗的菌落數;

A2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數)典型菌落的總數;

B2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數)鑒定為陽性的菌落數;

C2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數)用于鑒定試驗的菌落數;

1.1———計算系數;

d ———稀釋因子(稀釋度)。

報告

根據公式計算結果,報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌數,以 CFU/g(mL)表示;

如T 值為 0,則以小于1乘以稀釋倍數報告。